谷子(Setaria italica (L.) Beauv.)是世界上最古老的粮食作物之一，至今已有八千多年的栽培史(王永芳等, 2010)。谷子属C4植物，具有耐旱、耐盐、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，也是开展作物抗旱机理及C4光合系统发育与调控研究的新模式作物(Doust et al., 2009; 贾小平等, 2009a)。谷子是二倍体自花授粉作物，基因组较小，约470 Mb，与水稻基因组结构存在明显的共线性，是进行基因组研究的理想作物(王军等, 2011)。
SSR标记广泛应用于遗传多样性、品种鉴定、高密度物理图谱构建、功能基因组研究等领域。在谷子中，贾小平(Jia et al., 2007; 贾小平等, 2009b)、马丽华(马丽华, 2007, 私人通讯)、李琳(李琳, 2008, 私人通讯)分别利用EST文库、SAM、锚定PCR和微卫星富集等方法开发出一批SSR标记。传统的SSR标记开发需构建基因组文库，操作复杂，开发效率低。现有的谷子SSR标记数量少，不能满足谷子多方面研究的需要，大量开发覆盖全基因组的SSR标记仍是目前谷子研究的重要工作之一。

本研究通过对谷子基因组序列进行SSR位点的搜索，分析了谷子基因组SSR (genomic SSR, gSSR)的发生频率与特点，开发出一批SSR标记，为下一步大量开发谷子SSR标记打下良好基础。

1结果与分析
1.1谷子基因组中SSR的分布、频率及特点
对谷子基因组进行SSR搜索，在21 150.78 kb (占基因组序列的5.27%)序列中共搜索到2 872个SSR，平均每7.36 kb就有一个SSR。二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位，二者共占SSR总数的95.30%，其中二核苷酸为明显的优势重复类型，占总数的63.41%。其它类型出现频率总计不足5% (表1)。
 

表1 谷子中SSR出现频率 Table 1 SSR frequency in the genome of foxtail millet

本研究查找到的SSR序列总长度为45 239 bp，占序列全长的0.01%。SSR序列长度变化范围是10~160 bp，平均长度为15.75 bp。不同类型SSR长度变化范围差异很大，二核苷酸的长度变化范围最大(10~160 bp)，六核苷酸长度变化范围最小(30~54 bp)。从SSR长度来看，40个碱基以上的有74个，占2.58%，20~40个碱基的有410个，占14.28% (数据未列出)。二核苷酸中，AT/TA平均长度最大，为15.22 bp，GC/CG平均长度最小，为11.06 bp。三核苷酸中，TTA/AAT平均长度最大，为23.70 bp，AAC/TTG平均长度最小，为15 bp (表2)。由此可以看出，富含A/T的基元长度较大，而富含G/C的基元长度较小。
 

表2 谷子不同重复基元类型SSR的数量, 长度及频率 Table 2 Number, length and frequency of SSRs with different repeat motifs in foxtail millet

1.2 SSR引物稳定性评价
对74个重复次数在20以上或者重复碱基数在40以上的SSR位点设计了引物。其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复类型位点分别为58、3和2个，另有10个复合型位点，1个间断型SSR位点。以8份谷子品种DNA为模板进行PCR扩增，共有64对引物能够稳定扩增，有效扩增率达到86.49%。

1.3 SSR引物多态性检测
用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测40对引物的扩增产物在27份谷子品种中的多态性。13对引物缺失扩增较多(仅在少数几个材料中扩增)或者不易读多态性位点，27对(67.5%)扩增良好，多态性丰富。27对引物共检测到220个等位变异，每对引物检测出的等位变异数为5~15个，平均8.15个。其中，S127检测到的等位变异最多，在27份品种中有15个等位变异，S15、S7、S134也分别检测到12、13、14个等位变异；多态性信息量(PIC)变化范围是0.485 9~0.904 0，平均为0.758 9，PIC值在0.8以上的共有10对引物，S134的PIC值最高为0.904 0 (表3)。图1为引物S134在27份谷子品种中检测到的多态性。
 

表3 27对多态性引物信息 Table 3 Primer sequences, motifs, sizes of PCR products, annealing temperatures, number of alleles and PIC value of 27 SSR loci in foxtail millet

 

图1 引物S134在27份谷子品种中的扩增带型 Figure 1 Polymorphism detected in 27 foxtail millet varieties using primer pair S134

2讨论
本研究在21 150.78 kb谷子基因组序列(占全基因组序列的5.2%)中共搜索到2 872个SSR，平均每7.36 kb就有一个SSR，高于玉米基因组(http://www.tiaozhanbei.net/project/10083/)。SSR基元类型共有126种，二核苷酸重复基元出现频率最高，其次是三核苷酸，这与水稻(McCouch et al., 2002)、高粱(余传涨, 2010)、苹果(关玲等, 2011)基因组中微卫星类型分布情况相同。一般认为，低级重复基元的大量存在暗示着该物种进化水平较高，而高级重复基元出现频率高的物种具有较短的进化时间或较低的变异频率(Tóth et al., 2000; 高亚梅等, 2008; Harr and Schlötterer, 2000)。谷子基因组中二核苷酸和三核苷酸重复基元出现频率达95.27%，说明谷子基因组具有较高的变异频率和较久的进化历史。

本研究表明，谷子基因组中最主要的基元类型是GA/CT，其次是AT/TA，再次是TC/AG。二核苷酸重复类型中，GA/CT、AT/TA、TC/AG为优势基元，三核苷酸重复类型主要是富含G/C的基元，GCC/CGG、CGC/GCG和GGC/CCG三种类型共占43.12%，与水稻(McCouch et al., 2002)、小麦(Song et al., 2005)、杨梅(Jiao et al., 2012)一致。然而，大豆(Yaish and Pérez de la Vega, 2003)、拟南芥(Lawson and Zhang, 2006)等双子叶植物三核苷酸重复基元中GCC/CGG数量则较少，苹果(关玲等, 2011)二核苷酸重复基元主要是AT/TA，这可能与不同物种密码子的使用偏好性有关。统计谷子中SSR长度，发现富含A/T的基元长度较大，而富含G/C的基元长度较小，跟水稻(McCouch et al., 2002)研究结果一致。

Jia等(2007)用从谷子干旱胁迫EST文库中获得的30对SSR引物，在12份谷子和1份狗尾草材料中扩增，4对引物表现出多态性，扩增多态率为13.3%；马丽华(马丽华, 2007, 私人通讯)等用5'锚定PCR方法，设计222对引物，用8份谷子和7份狗尾草材料进行多态性检验，得到56对多态性引物，多态率为25.2%；Jia等(2009)利用(GA)n和(CA)n两个富集文库，开发了269对SSR引物，对1份青狗尾草和4份谷子品种进行扩增，其中179对(67%)扩增产物表现多态性。本研究从40对引物中筛选出27对多态性引物，多态率为67.5%，高于前人开发的引物。这可能与本研究选择设计引物的SSR基元重复次数较高有关。Dreisigacker等(2004)发现低级基元的SSR多态性普遍比高级基元高，谷子基因组SSR中，二核苷酸和三核苷酸SSR比例占95.27%，这也为开发谷子多态性SSR标记奠定了基础。

本研究开发的27个多态性SSR标记在27份谷子DUS测试标准品种中共检测到220个等位变异，平均每个位点的等位变异数为8.15个，引物的平均PIC值为0.785 2，表明本研究开发的引物有着较高的检测效率，可有效用于谷子品种鉴定和遗传多样性研究，同时说明谷子微卫星等位基因的变异较丰富，此结果与马丽华(马丽华, 2007, 私人通讯)的研究结果不一致，与Wang等(2012)的研究结果相似，原因可能是采用的引物与材料不同。当前中国谷子栽培品种和育成品种面临着遗传背景狭窄，骨干亲本单一的问题(贾小平等, 2009a)。谷子中有许多优异基因，比如抗旱、耐瘠薄等，利用多态性SSR标记发掘优异品种资源，进行基因精细定位，应用于分子标记辅助选择育种。 

本研究对部分谷子基因组DNA序列进行了SSR位点搜索，对谷子基因组中SSR的分布、频率及特点进行了分析，对部分SSR位点设计了引物并进行了多态性检测，获得了一批多态性高的SSR引物。随着该项研究的深入进行，有望获得一大批的扩增稳定、多态性丰富的谷子SSR标记，应用于谷子遗传多样性、品种鉴定、高密度物理图谱构建、功能基因组研究等领域。

3材料与方法
3.1材料
3.1.1谷子基因组序列 谷子全基因组测序结果从谷子基因组数据库Phytozome (http://www.phytozome.net/Setaria italica)下载，约405.7 Mb，共包含336个scaffolds，基因组覆盖率为83%。

3.1.2谷子品种
选取27份谷子特异性、一致性和稳定性测试(DUS测试)标准品种，用于引物的稳定性评价和多态性检测。品种编号和材料名称见表4。
 

表4 27份谷子品种 Table 4 27 foxtail millet varieties used in this study

3.2方法
3.2.1谷子SSR引物的开发
利用SSRHunter1.3 (李强和万建民, 2005)软件进行SSR位点的搜索，设置重复次数至少为5、构成重复基元的核苷酸数最多是6个。选取重复次数在20以上或者重复碱基数在40以上的SSR位点，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 5.0设计引物。引物设计的条件是：PCR产物长度为100~350 bp；退火温度(Tm)为50℃~70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC含量为40%~65%；引物长度为18~28 bp；引物5'端最好是G/C，3'端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20~30个碱基。引物设计后由上海生工生物工程有限公司合成。

3.2.2 DNA的提取
采用Weising等(1994)的CTAB法提取基因组的DNA。

3.2.3 PCR反应体系及扩增程序
PCR体系(12.5 μL)包括1.25 μL 10×Taq Buffer，1.5 mmol/L Mg²⁺，0.25 mmol/L dNTP，上下游引物各0.4 mmol/L，0.5 U Taq酶和20~50 ng DNA模板。PCR程序为：94℃预变性4 min；94℃ 45 s，(Tm)℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。

3.2.4扩增产物检测
采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。取3 μL扩增产物，以pBR322 DNA/MspⅠ为DNA分子量标准，60 W恒功率下电泳2 h，硝酸银染色。

3.2.5数据分析
根据DNA分子量标准和引物的迁移率记录结果，迁移率最大(分子量最小)的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次往后类推，无条带记为0。利用Power Marker V3.25 (Liu and Muse, 2005)计算统计引物的等位基因数(Na)、多态性信息量(polymorphism information content, PIC)。

作者贡献
张晗、王雪梅是本实验研究主要执行人；李汝玉、杨延兵、宋国安提供实验指导；王东建、孙加梅协助完成数据分析和论文初稿的写作；段丽丽、李华、王晓宇参与实验设计并完成分子生物学实验；李汝玉是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究得到了山东省自然科学基金(Q2007D05)的资助。

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